Ang likidong kromatograpiya ay ang pangunahing pamamaraan para sa pagsubok ng nilalaman ng bawat bahagi at mga dumi sa mga hilaw na materyales, mga intermediate, paghahanda at mga materyales sa packaging, ngunit maraming mga sangkap ay walang karaniwang mga pamamaraan upang umasa, kaya hindi maiiwasang bumuo ng mga bagong pamamaraan. Sa pagbuo ng mga pamamaraan ng liquid phase, ang chromatographic column ay ang core ng liquid chromatography, kaya kung paano pumili ng angkop na chromatographic column ay napakahalaga. Sa artikulong ito, ipapaliwanag ng may-akda kung paano pumili ng column ng liquid chromatography mula sa tatlong aspeto: pangkalahatang mga ideya, pagsasaalang-alang at saklaw ng aplikasyon.
A. Pangkalahatang mga ideya para sa pagpili ng mga column ng liquid chromatography
1. Suriin ang pisikal at kemikal na mga katangian ng analyte: tulad ng kemikal na istraktura, solubility, katatagan (tulad ng kung ito ay madaling ma-oxidized/reduced/hydrolyzed), acidity at alkalinity, atbp., lalo na ang kemikal na istraktura ay ang susi kadahilanan sa pagtukoy ng mga katangian, tulad ng conjugated group ay may malakas na pagsipsip ng ultraviolet at malakas na fluorescence;
2. Tukuyin ang layunin ng pagsusuri: kung kinakailangan ang mataas na paghihiwalay, mataas na kahusayan ng haligi, maikling oras ng pagsusuri, mataas na sensitivity, mataas na presyon ng pagtutol, mahabang buhay ng haligi, mababang gastos, atbp.;
- Pumili ng angkop na chromatographic column: unawain ang komposisyon, pisikal at kemikal na katangian ng chromatographic filler, gaya ng laki ng particle, laki ng butas, temperature tolerance, pH tolerance, adsorption ng analyte, atbp.
- Mga pagsasaalang-alang para sa pagpili ng mga column ng liquid chromatography
Tatalakayin ng kabanatang ito ang mga salik na dapat isaalang-alang kapag pumipili ng column ng chromatography mula sa pananaw ng mga katangiang pisikal at kemikal ng column mismo ng chromatography. 2.1 Filler matrix
2.1.1 Silica gel matrix Ang filler matrix ng karamihan sa liquid chromatography column ay silica gel. Ang ganitong uri ng filler ay may mataas na kadalisayan, mababang gastos, mataas na mekanikal na lakas, at madaling baguhin ang mga grupo (tulad ng phenyl bonding, amino bonding, cyano bonding, atbp.), ngunit ang pH value at temperatura na pinahihintulutan nito ay limitado: ang pH range ng karamihan sa silica gel matrix fillers ay 2 hanggang 8, ngunit ang pH range ng mga espesyal na binagong silica gel bonded phase ay maaaring kasing lapad ng 1.5 hanggang 10, at mayroon ding mga espesyal na binagong silica gel bonded phase na stable sa mababang pH, tulad ng Agilent ZORBAX RRHD stablebond-C18, na stable sa pH 1 hanggang 8; ang pinakamataas na limitasyon ng temperatura ng silica gel matrix ay karaniwang 60 ℃, at ang ilang mga haligi ng chromatography ay maaaring tiisin ang temperatura na 40 ℃ sa mataas na pH.
2.1.2 Polymer matrix Ang mga polymer filler ay kadalasang polystyrene-divinylbenzene o polymethacrylate. Ang kanilang mga bentahe ay na maaari nilang tiisin ang isang malawak na hanay ng pH - maaari silang magamit sa hanay ng 1 hanggang 14, at mas lumalaban sila sa mataas na temperatura (maaaring umabot sa itaas ng 80 °C). Kung ikukumpara sa mga silica-based na C18 filler, ang ganitong uri ng filler ay may mas malakas na hydrophobicity, at ang macroporous polymer ay napaka-epektibo sa paghihiwalay ng mga sample gaya ng mga protina. Ang mga disadvantage nito ay ang kahusayan ng haligi ay mas mababa at ang mekanikal na lakas ay mas mahina kaysa sa mga tagapuno na nakabatay sa silica. 2.2 Hugis ng butil
Karamihan sa mga modernong tagapuno ng HPLC ay mga spherical na particle, ngunit kung minsan ang mga ito ay hindi regular na mga particle. Ang mga spherical na particle ay maaaring magbigay ng mas mababang presyon ng haligi, mas mataas na kahusayan ng haligi, katatagan at mas mahabang buhay; kapag gumagamit ng mga high-viscosity mobile phase (tulad ng phosphoric acid) o kapag ang sample na solusyon ay malapot, ang mga irregular na particle ay may mas malaking partikular na surface area, na mas nakakatulong sa buong pagkilos ng dalawang phase, at medyo mababa ang presyo. 2.3 Laki ng particle
Kung mas maliit ang laki ng butil, mas mataas ang kahusayan ng haligi at mas mataas ang paghihiwalay, ngunit mas masahol pa ang mataas na pagtutol sa presyon. Ang pinakakaraniwang ginagamit na column ay ang 5 μm particle size column; kung mataas ang kinakailangan sa paghihiwalay, maaaring pumili ng 1.5-3 μm na tagapuno, na nakakatulong sa paglutas ng problema sa paghihiwalay ng ilang kumplikadong matrix at multi-component na sample. Ang UPLC ay maaaring gumamit ng 1.5 μm na mga tagapuno; Ang 10 μm o mas malaking particle size filler ay kadalasang ginagamit para sa semi-preparative o preparative column. 2.4 Nilalaman ng carbon
Ang carbon content ay tumutukoy sa proporsyon ng bonded phase sa ibabaw ng silica gel, na nauugnay sa partikular na surface area at bonded phase coverage. Ang mataas na carbon content ay nagbibigay ng mataas na kapasidad ng column at mataas na resolution, at kadalasang ginagamit para sa mga kumplikadong sample na nangangailangan ng mataas na paghihiwalay, ngunit dahil sa mahabang oras ng pakikipag-ugnayan sa pagitan ng dalawang phase, ang oras ng pagsusuri ay mahaba; Ang mga column na chromatographic na may mababang nilalaman ng carbon ay may mas maikling oras ng pagsusuri at maaaring magpakita ng iba't ibang pagpili, at kadalasang ginagamit para sa mga simpleng sample na nangangailangan ng mabilis na pagsusuri at mga sample na nangangailangan ng mataas na kondisyon ng aqueous phase. Sa pangkalahatan, ang nilalaman ng carbon ng C18 ay mula 7% hanggang 19%. 2.5 Laki ng butas at tiyak na lugar sa ibabaw
Ang HPLC adsorption media ay mga maliliit na particle, at karamihan sa mga pakikipag-ugnayan ay nagaganap sa mga pores. Samakatuwid, ang mga molekula ay dapat pumasok sa mga pores upang ma-adsorbed at mahiwalay.
Ang laki ng butas at tiyak na lugar sa ibabaw ay dalawang pantulong na konsepto. Ang maliit na laki ng butas ay nangangahulugan ng malaking tiyak na lugar sa ibabaw, at kabaliktaran. Ang isang malaking partikular na lugar sa ibabaw ay maaaring tumaas ang pakikipag-ugnayan sa pagitan ng mga sample na molekula at mga bonded phase, mapahusay ang pagpapanatili, dagdagan ang pag-load ng sample at kapasidad ng column, at paghihiwalay ng mga kumplikadong bahagi. Ang mga ganap na porous na tagapuno ay nabibilang sa ganitong uri ng mga tagapuno. Para sa mga may mataas na kinakailangan sa paghihiwalay, inirerekumenda na pumili ng mga tagapuno na may malaking tiyak na lugar sa ibabaw; Ang maliit na tiyak na lugar sa ibabaw ay maaaring mabawasan ang presyon sa likod, mapabuti ang kahusayan ng haligi, at bawasan ang oras ng balanse, na angkop para sa pagsusuri ng gradient. Ang mga core-shell filler ay nabibilang sa ganitong uri ng mga filler. Sa saligan ng pagtiyak ng paghihiwalay, inirerekumenda na pumili ng mga tagapuno na may maliit na tiyak na lugar sa ibabaw para sa mga may mataas na kinakailangan sa kahusayan sa pagsusuri. 2.6 Dami ng butas at lakas ng makina
Ang pore volume, na kilala rin bilang "pore volume", ay tumutukoy sa laki ng void volume bawat unit particle. Maaari itong mahusay na sumasalamin sa mekanikal na lakas ng tagapuno. Ang mekanikal na lakas ng mga tagapuno na may malaking dami ng butas ay bahagyang mas mahina kaysa sa mga tagapuno na may maliit na dami ng butas. Ang mga filler na may pore volume na mas mababa sa o katumbas ng 1.5 mL/g ay kadalasang ginagamit para sa HPLC separation, habang ang mga filler na may pore volume na higit sa 1.5 mL/g ay pangunahing ginagamit para sa molecular exclusion chromatography at low-pressure chromatography. 2.7 Rate ng capping
Maaaring bawasan ng capping ang mga tailing peak na dulot ng interaksyon sa pagitan ng mga compound at nakalantad na silanol group (tulad ng ionic bonding sa pagitan ng alkaline compound at silanol group, van der Waals forces at hydrogen bonds sa pagitan ng acidic compound at silanol group), at sa gayon ay nagpapabuti ng column efficiency at peak shape. . Ang mga uncaped bonded phase ay gagawa ng iba't ibang selectivity na may kaugnayan sa mga naka-cap na bonded phase, lalo na para sa mga polar sample.
- Saklaw ng aplikasyon ng iba't ibang column ng liquid chromatography
Ilalarawan ng kabanatang ito ang saklaw ng aplikasyon ng iba't ibang uri ng mga column ng liquid chromatography sa ilang mga kaso.
3.1 Reversed-phase C18 chromatographic column
Ang C18 column ay ang pinakakaraniwang ginagamit na reversed-phase column, na makakatugon sa content at impurity test ng karamihan sa mga organic na substance, at naaangkop sa medium-polar, weakly polar at non-polar substance. Ang uri at detalye ng C18 chromatographic column ay dapat piliin ayon sa mga partikular na kinakailangan sa paghihiwalay. Halimbawa, para sa mga sangkap na may mataas na kinakailangan sa paghihiwalay, kadalasang ginagamit ang 5 μm*4.6 mm*250 mm na mga pagtutukoy; para sa mga substance na may kumplikadong separation matrice at katulad na polarity, 4 μm*4.6 mm*250 mm na mga detalye o mas maliit na laki ng particle ay maaaring gamitin. Halimbawa, gumamit ang may-akda ng column na 3 μm*4.6 mm*250 mm para makita ang dalawang genotoxic na impurities sa celecoxib API. Ang paghihiwalay ng dalawang sangkap ay maaaring umabot sa 2.9, na napakahusay. Bilang karagdagan, sa ilalim ng saligan ng pagtiyak ng paghihiwalay, kung kinakailangan ang mabilis na pagsusuri, ang isang maikling haligi na 10 mm o 15 mm ay madalas na napili. Halimbawa, nang gumamit ang may-akda ng LC-MS/MS para makita ang isang genotoxic na impurity sa piperaquine phosphate API, ginamit ang isang column na 3 μm*2.1 mm*100 mm. Ang paghihiwalay sa pagitan ng karumihan at ng pangunahing bahagi ay 2.0, at ang pagtuklas ng isang sample ay maaaring makumpleto sa loob ng 5 minuto. 3.2 Reversed-phase phenyl column
Ang Phenyl column ay isa ring uri ng reversed-phase column. Ang ganitong uri ng column ay may malakas na selectivity para sa mga aromatic compound. Kung mahina ang tugon ng mga aromatic compound na sinusukat ng ordinaryong C18 column, maaari mong isaalang-alang ang pagpapalit ng phenyl column. Halimbawa, noong gumagawa ako ng celecoxib API, ang pangunahing bahagi ng tugon na sinusukat ng phenyl column ng parehong manufacturer at ang parehong detalye (lahat ng 5 μm*4.6 mm*250 mm) ay humigit-kumulang 7 beses kaysa sa column na C18. 3.3 Normal-phase column
Bilang isang epektibong suplemento sa reversed-phase column, ang normal-phase na column ay angkop para sa mataas na polar compound. Kung ang peak ay napakabilis pa rin kapag nag-eluting na may higit sa 90% aqueous phase sa reversed-phase column, at kahit na malapit at magkakapatong sa solvent peak, maaari mong isaalang-alang ang pagpapalit ng normal na phase na column. Kasama sa ganitong uri ng column ang hilic column, amino column, cyano column, atbp.
3.3.1 Hilic column Hilic column ay karaniwang naglalagay ng mga hydrophilic na grupo sa nakagapos na alkyl chain upang pahusayin ang tugon sa mga polar substance. Ang ganitong uri ng haligi ay angkop para sa pagsusuri ng mga sangkap ng asukal. Ginamit ng may-akda ang ganitong uri ng column kapag ginagawa ang nilalaman at mga kaugnay na sangkap ng xylose at mga derivatives nito. Ang mga isomer ng isang xylose derivative ay maaari ding maayos na paghiwalayin;
3.3.2 Amino column at cyano column Ang Amino column at cyano column ay tumutukoy sa pagpapakilala ng amino at cyano modifications sa dulo ng bonded alkyl chain, ayon sa pagkakabanggit, upang mapabuti ang selectivity para sa mga espesyal na substance: halimbawa, amino column ay isang magandang pagpipilian para sa paghihiwalay ng mga sugars, amino acids, bases, at amides; cyano column ay may mas mahusay na selectivity kapag naghihiwalay ng hydrogenated at unhydrogenated structural katulad na mga sangkap dahil sa pagkakaroon ng conjugated bonds. Ang Amino column at cyano column ay kadalasang maaaring ilipat sa pagitan ng normal na phase column at reverse phase column, ngunit ang madalas na paglipat ay hindi inirerekomenda. 3.4 Hanay ng kiral
Ang column ng chiral, gaya ng ipinahihiwatig ng pangalan, ay angkop para sa paghihiwalay at pagsusuri ng mga chiral compound, lalo na sa larangan ng mga parmasyutiko. Ang ganitong uri ng column ay maaaring isaalang-alang kapag ang conventional reverse phase at normal na phase column ay hindi makakamit ang paghihiwalay ng mga isomer. Halimbawa, gumamit ang may-akda ng 5 μm*4.6 mm*250 mm chiral column upang paghiwalayin ang dalawang isomer ng 1,2-diphenylethylenediamine: (1S, 2S)-1, 2-diphenylethylenediamine at (1R, 2R)-1, 2 -diphenylethylenediamine, at ang paghihiwalay sa pagitan ng dalawa ay umabot sa humigit-kumulang 2.0. Gayunpaman, ang mga chiral na column ay mas mahal kaysa sa iba pang uri ng mga column, karaniwang 1W+/piece. Kung may pangangailangan para sa mga naturang column, ang yunit ay kailangang gumawa ng sapat na badyet. 3.5 Ion exchange column
Ang mga column ng palitan ng ion ay angkop para sa paghihiwalay at pagsusuri ng mga naka-charge na ion, tulad ng mga ion, protina, nucleic acid, at ilang sangkap ng asukal. Ayon sa uri ng tagapuno, nahahati ang mga ito sa mga column ng cation exchange, mga column ng anion exchange, at strong na mga column ng cation exchange.
Kasama sa mga column ng cation exchange ang calcium-based at hydrogen-based na column, na pangunahing angkop para sa pagsusuri ng mga cationic substance tulad ng mga amino acid. Halimbawa, gumamit ang may-akda ng mga column na nakabatay sa calcium kapag sinusuri ang calcium gluconate at calcium acetate sa isang flushing solution. Ang parehong mga sangkap ay may malakas na tugon sa λ=210nm, at ang antas ng paghihiwalay ay umabot sa 3.0; gumamit ang may-akda ng mga column na nakabatay sa hydrogen kapag sinusuri ang mga sangkap na nauugnay sa glucose. Maraming mga pangunahing nauugnay na sangkap - maltose, maltotriose at fructose - ay may mataas na sensitivity sa ilalim ng mga differential detector, na may limitasyon sa pagtuklas na kasingbaba ng 0.5 ppm at isang separation degree na 2.0-2.5.
Ang mga haligi ng pagpapalitan ng anion ay pangunahing angkop para sa pagsusuri ng mga anionic na sangkap tulad ng mga organikong acid at halogen ions; Ang malakas na cation exchange column ay may mas mataas na ion exchange capacity at selectivity, at angkop para sa paghihiwalay at pagsusuri ng mga kumplikadong sample.
Ang nasa itaas ay isang panimula lamang sa mga uri at saklaw ng aplikasyon ng ilang karaniwang mga column ng liquid chromatography na sinamahan ng sariling karanasan ng may-akda. Mayroong iba pang mga espesyal na uri ng mga column ng chromatographic sa mga aktwal na aplikasyon, tulad ng mga column na chromatographic na may malalaking butas, mga column na chromatographic na may maliit na butas, mga column ng affinity chromatography, mga column ng multimode chromatographic, mga column na ultra-high performance na liquid chromatography (UHPLC), mga column ng supercritical fluid chromatography ( SFC), atbp. Malaki ang papel nila sa iba't ibang larangan. Ang partikular na uri ng chromatographic column ay dapat piliin ayon sa istraktura at mga katangian ng sample, mga kinakailangan sa paghihiwalay at iba pang mga layunin.
Oras ng post: Hun-14-2024