Mga Prinsipyo at Paraan ng Quantitative Analysis sa pamamagitan ng Liquid Chromatography

Ang mekanismo ng paghihiwalay ng likidong kromatograpiya ay batay sa pagkakaiba sa pagkakaugnay ng mga sangkap sa pinaghalong para sa dalawang yugto.

Ayon sa iba't ibang mga nakatigil na yugto, ang likidong kromatograpiya ay nahahati sa likido-solid na kromatograpiya, likido-likidong kromatograpiya at nakagapos na yugto ng kromatograpiya.Ang pinaka-malawak na ginagamit ay likido-solid chromatography na may silica gel bilang tagapuno at bonded phase chromatography na may microsilica bilang matrix.

Ayon sa anyo ng nakatigil na yugto, ang likidong chromatography ay maaaring nahahati sa column chromatography, paper chromatography at thin layer chromatography.Ayon sa kapasidad ng adsorption, maaari itong nahahati sa adsorption chromatography, partition chromatography, ion exchange chromatography at gel permeation chromatography.

Sa mga nakalipas na taon, ang isang high-pressure na liquid flow system ay idinagdag sa liquid column chromatography system upang gawing mabilis ang daloy ng mobile phase sa ilalim ng mataas na presyon upang mapabuti ang separation effect, kaya high-efficiency (kilala rin bilang high-pressure) liquid chromatography ay lumitaw.

BAHAGI
01 Prinsipyo ng Quantitative Analysis ng Liquid Chromatography

Upang mabilang sa batayan ng husay, ang mga dalisay na sangkap ay kinakailangan bilang mga pamantayan;

Ang liquid chromatography quantification ay isang medyo quantitative method: iyon ay, ang dami ng analyte sa mixture ay tinatantya mula sa isang kilalang halaga ng purong standard sample

BAHAGI
02 Batayan para sa Quantification sa pamamagitan ng Liquid Chromatography

Ang dami ng sinusukat na bahagi (W) ay proporsyonal sa halaga ng tugon (A) (tugatog na taas o peak area), W=f×A.

Quantitative correction factor (f): Ito ang proportionality constant ng quantitative calculation formula, at ang pisikal na kahulugan nito ay ang dami ng sinusukat na bahagi na kinakatawan ng unit response value (peak area).

Ang quantitative correction factor ay maaaring makuha mula sa kilalang dami ng karaniwang sample at ang response value nito.

Sukatin ang halaga ng tugon ng hindi kilalang bahagi, at ang halaga ng bahagi ay maaaring makuha ng quantitative correction factor.

BAHAGI
03 Mga karaniwang termino sa quantitative analysis

Sample (sample): isang solusyon na naglalaman ng analyte para sa chromatographic analysis.Nahahati sa karaniwan at hindi kilalang mga sample.

Pamantayan: Isang purong produkto na may kilalang konsentrasyon.Hindi kilalang sample (hindi alam): Ang timpla na ang konsentrasyon ay susuriin.

Timbang ng sample: Ang orihinal na pagtimbang ng sample na susuriin.

Dilution: Ang dilution factor ng hindi kilalang sample.

Component : ang chromatographic peak na susuriin sa dami, iyon ay, ang analyte na hindi alam ang nilalaman.

Dami ng bahagi (dami): ang nilalaman (o konsentrasyon) ng sangkap na susuriin.

Integerity : Ang computational na proseso ng pagsukat ng peak area ng isang chromatographic peak ng isang computer.

Calibration curve: Isang linear curve ng content ng component kumpara sa value ng tugon, na itinatag mula sa isang kilalang dami ng karaniwang substance, na ginagamit upang matukoy ang hindi alam na content ng analyte.

BAHAGI
04 Dami ng Pagsusuri ng Liquid Chromatography

1. Pumili ng chromatographic method na angkop para sa quantitative analysis:

l Kumpirmahin ang peak ng natukoy na bahagi at makamit ang isang resolution (R) na higit sa 1.5

l Tukuyin ang pagkakapare-pareho (kadalisayan) ng mga chromatographic peak ng nasubok na mga bahagi

l Tukuyin ang limitasyon sa pagtuklas at limitasyon ng dami ng pamamaraan;sensitivity at linear range

2. Magtatag ng calibration curve na may mga karaniwang sample ng iba't ibang konsentrasyon

3. Suriin ang katumpakan at katumpakan ng mga pamamaraan ng dami

4. Gamitin ang kaukulang software sa pamamahala ng chromatography upang ipatupad ang pagkolekta ng sample, pagproseso ng data at mga resulta ng pag-uulat

BAHAGI
05 Pagkilala sa mga quantitative peak (qualitative)

Kwalitatibong tukuyin ang bawat chromatographic peak na susukuan

Una, gamitin ang karaniwang sample upang matukoy ang oras ng pagpapanatili (Rt) ng chromatographic peak na susukuan.Sa pamamagitan ng paghahambing sa oras ng pagpapanatili, hanapin ang bahagi na tumutugma sa bawat chromatographic peak sa hindi kilalang sample.Ang chromatographic qualitative method ay upang ihambing ang oras ng pagpapanatili sa karaniwang sample.Hindi sapat ang pamantayankaragdagang kumpirmasyon (kuwalitatibo)

1. Pamamaraan ng karaniwang pagdaragdag

2. Gumamit ng iba pang mga pamamaraan nang sabay-sabay: iba pang mga chromatographic na pamamaraan (baguhin ang mekanismo, tulad ng: gamit ang iba't ibang mga chromatographic column), iba pang mga detector (PDA: spectrum comparison, spectrum library search; MS: mass spectrum analysis, spectrum library search)

3. Iba pang mga instrumento at pamamaraan

BAHAGI
06 Pagkumpirma ng Quantitative Peak Consistency

Kumpirmahin ang chromatographic peak consistency (purity)

Tiyakin na mayroon lamang isang nasusukat na bahagi sa ilalim ng bawat chromatographic peak

Suriin kung may interference mula sa mga co-eluting substance (mga impurities)

Mga Paraan para sa Pagkumpirma ng Chromatographic Peak Consistency (Purity)

Paghahambing ng Spectrograms sa Photodiode Matrix (PDA) Detector

Peak Purity Identification

2996 Teorya ng Anggulo ng Kadalisayan

Mga paraan ng dami na karaniwang ginagamit sa BAHAGI 07

Standard curve method, nahahati sa external standard method at internal standard method:

1. Panlabas na pamantayang pamamaraan: pinaka ginagamit sa liquid chromatography

Ang isang serye ng mga karaniwang sample ng mga kilalang konsentrasyon ay inihanda gamit ang mga purong sample ng mga compound na susuriin bilang mga karaniwang sample.iniksyon sa column hanggang sa halaga ng tugon nito (peak area).
Sa loob ng isang tiyak na hanay, mayroong isang mahusay na linear na relasyon sa pagitan ng konsentrasyon ng karaniwang sample at ang halaga ng tugon, katulad W= f×A, at isang karaniwang kurba ang ginawa.

Sa ilalim ng eksaktong parehong pang-eksperimentong kundisyon, mag-iniksyon ng hindi kilalang sample upang makuha ang halaga ng tugon ng sangkap na susukatin .Ayon sa kilalang coefficient f , ang konsentrasyon ng sangkap na susukatin ay maaaring makuha.

Ang mga bentahe ng panlabas na pamantayang pamamaraan:simpleng operasyon at pagkalkula, ito ay isang karaniwang ginagamit na paraan ng dami;hindi na kailangan para sa bawat bahagi na matukoy at maalis;kinakailangan ang karaniwang sample;ang mga kondisyon ng pagsukat ng karaniwang sample at hindi kilalang sample ay dapat na pare-pareho;ang dami ng iniksyon ay dapat na tumpak.

Mga disadvantages ng panlabas na pamantayang pamamaraan:Ang mga pang-eksperimentong kundisyon ay kailangang mataas, tulad ng sensitivity ng detector, ang flow rate, at ang komposisyon ng mobile phase ay hindi mababago;ang dami ng bawat iniksyon ay dapat magkaroon ng magandang repeatability.

2. Panloob na pamantayang pamamaraan: tumpak, ngunit mahirap, pinaka ginagamit sa mga karaniwang pamamaraan

Ang isang kilalang halaga ng panloob na pamantayan ay idinagdag sa pamantayan upang makagawa ng isang halo-halong pamantayan, at isang serye ng mga pamantayan sa pagtatrabaho ng kilalang konsentrasyon ay inihanda.Ang molar ratio ng pamantayan sa panloob na pamantayan sa halo-halong pamantayan ay nananatiling hindi nagbabago.Mag-inject sa chromatographic column at kunin (standard sample peak area/internal standard sample peak area) bilang ang response value.Ayon sa linear na relasyon sa pagitan ng halaga ng tugon at ang konsentrasyon ng pamantayan sa pagtatrabaho, katulad W= f×A, isang karaniwang curve ang ginawa.

Ang isang kilalang halaga ng panloob na pamantayan ay idinaragdag sa hindi kilalang sample at ini-inject sa column upang makuha ang halaga ng tugon ng sangkap na susukatin.Ayon sa kilalang coefficient f , ang konsentrasyon ng sangkap na susukatin ay maaaring makuha.

Mga katangian ng panloob na pamantayang pamamaraan:Sa panahon ng operasyon, ang sample at ang panloob na pamantayan ay pinaghalo at ini-inject sa chromatographic column, kaya hangga't ang ratio ng dami ng sinusukat na bahagi sa panloob na pamantayan sa pinaghalong solusyon ay pare-pareho, ang pagbabago ng dami ng sample hindi makakaapekto sa dami ng mga resulta..Bina-offset ng internal standard na paraan ang impluwensya ng sample volume , at maging ang mobile phase at detector, kaya mas tumpak ito kaysa sa external na standard na paraan.

BAHAGI
08 Mga Salik na Nakakaapekto sa Mga Resulta ng Pagsusuri ng Dami

Ang mahinang katumpakan ay maaaring sanhi ng:

Maling pagsasama ng peak area, sample decomposition o impurities na ipinakilala habang naghahanda ng sample, sample vial na hindi selyado, sample o solvent volatilization, maling paghahanda ng sample, mga problema sa sample injection, hindi tamang internal standard na paghahanda

Mga posibleng dahilan para sa mahinang katumpakan:

Maling peak integration, mga problema sa injection o injector, sample decomposition o impurities na ipinakilala sa paghahanda ng sample, mga problema sa chromatographic, degraded detector response